Kisspeptinasyra mažos molekulės peptidas, sudarytas iš 54 aminorūgščių liekanų, kurių molekulinė masė yra maždaug 6000 daltonų. Jo aminorūgščių seka žinduoliuose yra labai konservuota, o tai reiškia, kad skirtingose rūšyse ji turi panašią struktūrą. Žmonėms Kisspeptin aminorūgščių seka yra H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Šis genas, užkoduotas Kiss1 geno, pirmiausia transkribuojamas į Kiss1 baltymo pirmtaką, kuris yra apdorojamas ir sujungiamas, kad galiausiai susidarytų subrendęs Kisspeptin. Kisspeptino skaidymas daugiausia vyksta per peptidazes, kurios suskaido jį į mažesnius fragmentus arba atskiras aminorūgštis. Vaidina svarbų vaidmenį reprodukcinėje sistemoje. Jis laikomas svarbiu gonadotropiną atpalaiduojančio hormono (GnRH) atpalaidavimo faktoriumi, kuris gali paskatinti gonadotropinų išsiskyrimą, taip skatindamas lytinių ląstelių brendimą ir ovuliaciją. Be to, Kisspeptin taip pat dalyvauja reguliuojant kitus fiziologinius procesus, tokius kaip emocijos, atmintis ir pažinimo funkcija.
Kisspeptino peptidas, taip pat žinomas kaip Kiss1 peptidas arba RFRP-1 peptidas, yra žmogaus organizme randamas neuropeptidas. Laboratorijoje Kisspeptin sintezei dažniausiai naudojami šie sintezės metodai:
Cheminė sintezė:
Cheminė sintezė yra dažniausiai naudojamas kisspeptino sintezės metodas laboratorijoje. Šis metodas apima kelias chemines reakcijas, tokias kaip kondensavimas, apsaugos pašalinimas ir gėlinimas. Tarp jų pagrindinis žingsnis yra peptidinių jungčių tarp aminorūgščių formavimas, paprastai naudojant klasikinius jungiamuosius agentus, tokius kaip EDC (1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) – karbodiimidas) arba BOP ( benzotriazol-1-il-oksi-tris (dimetilamino) fosfonio heksafluorofosfatas). Cheminės sintezės pranašumas yra tas, kad galima gauti labai gryną kisspeptiną, tačiau šio metodo trūkumas yra tai, kad reikia atlikti sudėtingus eksperimentinius veiksmus ir griežtas laboratorines sąlygas, o išeiga yra maža.
Konkretūs reakcijos etapai yra tokie:
1. Paruoškite pradines medžiagas. Tai apima reikiamas aminorūgštis, aktyvatorius (pvz., EDC arba BOP), apsaugos pašalinimo reagentus (pvz., trifluoracto rūgštį arba vandenilio bromo rūgštį), taip pat kitus būtinus reagentus ir buferinius tirpalus.
2. Esant bevandenėms ir be deguonies sąlygoms, reikiamas aminorūgštis ištirpinkite atitinkamuose tirpikliuose, tokiuose kaip dimetilformamidas (DMF) arba N, N-dimetilacetamidas (DMA).
3. Įpilkite reikiamo aktyvatoriaus (pvz., EDC arba BOP) ir tam tikrą laiką maišykite kambario temperatūroje, kad susidarytų peptidiniai ryšiai.
4. Į susidariusias peptidines jungtis įpilkite apsaugą mažinančių reagentų (pvz., trifluoracto rūgšties arba vandenilio bromo rūgšties), kad pašalintumėte apsaugines aminogrupes.
5. Pridėkite reikiamas apsaugines grupes (pvz., Boc arba Fmoc), kad apsaugotumėte naujai suformuotas aminogrupes.
6. Kartokite aukščiau nurodytus veiksmus, kol bus prijungtos visos reikalingos aminorūgštys.
7. Į peptidinę grandinę pridėkite reikiamas šoninės grandinės modifikacijas ir (arba) žymenis.
8. Galiausiai buvo atlikta apsaugos pašalinimo reakcija, siekiant pašalinti visas apsaugines grupes ir gauti išgrynintą kisspeptiną.
Aukščiau pateiktas pagrindinis cheminės sintezės metodas, o konkretūs žingsniai gali skirtis priklausomai nuo konkrečios Kisspeptin sekos ir reikalingų modifikacijų. Viso sintezės proceso metu būtina griežtai kontroliuoti eksperimentines sąlygas, įskaitant tirpiklį, temperatūrą, pH, laiką ir slėgį, kad būtų užtikrinta sklandi reakcijos eiga ir didelis produkto grynumas. Kartu būtina atkreipti dėmesį į cheminių reakcijų saugumą ir vengti pavojingų reagentų bei operacijų naudojimo.
Genų inžinerijos sintezė:
Genų inžinerijos sintezė yra efektyvus, greitas ir ekonomiškas Kisspeptin sintezės metodas. Šis metodas naudoja genų inžinerijos technologiją Kisspeptin pirmtako baltymo ekspresijai mikroorganizmuose, tokiuose kaip Escherichia coli arba mielės, ir vėliau apdorojamas, kad būtų gautas subrendęs Kisspeptin.
Toliau pateikiamas supaprastintas procesas:
1. Genų klonavimas: Pirmiausia reikia gauti Kisspeptin genų seką. Tai galima gauti iš biologinių audinių naudojant RT PGR, genomo sekos nustatymą ar kitus genų klonavimo metodus.
2. Vektoriaus pasirinkimas: Tada turite pasirinkti vektorių, kad būtų galima įdėti Kisspeptin genų seką. Paprastai tai yra nekenksminga bakterinė plazmidė arba virusinis vektorius. Vektorius skirtas įterpti Kisspeptin geną ir įnešti jį į ląstelę.
3. Genų transformacija: įterpkite Kisspeptin geną į vektorių, o tada perkelkite šį kompleksą (genas+vektorius) į inžinerines bakterijas, tokias kaip Escherichia coli arba mieles.
4. Ekspresija: inžinerinėse bakterijose Kisspeptin genas yra "skaitomas" ir vadovauja baltymų sintezei. Šie baltymai paprastai tvirtinami prie specialių cheminių etikečių, skirtų tolesniems gryninimo procesams.
5. Po apdorojimo. Šie kisspeptino pirmtakai, kuriuos gamina inžinerijos būdu sukurtos bakterijos, gali būti surinkti ir išvalyti atliekant tokius veiksmus kaip ląstelių suskaidymas, centrifugavimas ir dializė.
Šio metodo pranašumas yra tas, kad per trumpą laiką galima pagaminti didelį Kisspeptin kiekį, o kaina yra palyginti maža. Be to, dėl mikroorganizmų naudojimo šis gamybos būdas turi minimalų poveikį aplinkai. Tačiau šio metodo trūkumas yra tas, kad reikia manipuliuoti mikroorganizmais, todėl tam reikia tam tikros laboratorinės įrangos ir įgūdžių.
Biofermentinė hidrolizė:
Biofermentinė hidrolizė yra kisspeptino sintezės metodas naudojant fermentų katalizę. Šis metodas naudoja specifinius biologinius fermentus, kad kisspeptino pirmtakų baltymus paverstų subrendusiu kisspeptinu.
Pagrindiniai kisspeptino sintezės biologinės fermentinės hidrolizės etapai:
1. Genų klonavimas ir vektoriaus atranka: Pirmiausia vis tiek reikia gauti Kisspeptin genų seką, o tada pasirinkti vektorių, kad ją įterptumėte.
2. Ekspresija: įterpkite Kisspeptin geną į vektorių, o tada perkelkite šį kompleksą (genas+vektorius) į inžinerinę bakteriją.
3. Baltymų sintezė: Inžinerinėse bakterijose Kisspeptin genas yra "skaitomas" ir vadovauja baltymų sintezei. Šie baltymai dažniausiai tvirtinami prie specialių cheminių etikečių.
4. Biofermentinė hidrolizė: specifinių proteazių, tokių kaip subtilizinas arba tripsinas, naudojimas pirmtakų baltymams paversti subrendusiu kisspeptinu. Biologiniai fermentai pasižymi dideliu specifiškumu ir kataliziniu efektyvumu, todėl šis reakcijos etapas gali būti baigtas greitai ir efektyviai.
5. Po apdorojimo. Atlikus daugybę veiksmų, tokių kaip ląstelių suskaidymas, centrifugavimas, dializė ir kt., Kisspeptinas galiausiai surenkamas ir išgryninamas.
Šio metodo pranašumas yra tas, kad jis gali per trumpą laiką užbaigti Kisspeptin sintezę. Ne tik greitas sintezės greitis, bet ir itin didelis biologinių fermentų katalizinis efektyvumas, o tai gali labai pagerinti tikslinių baltymų išeigą. Tuo tarpu biologiniai fermentai, naudojami fermentinėje hidrolizėje, dažnai pasižymi dideliu specifiškumu ir gali tiksliai bei efektyviai veikti sudėtingose biologinėse molekulėse. Todėl šis metodas yra nekenksmingas aplinkai ir turi mažai įtakos tikslinio baltymo struktūrai ir funkcijai. Tačiau šis metodas taip pat turi tam tikrų apribojimų, pavyzdžiui, sunku gauti ir paruošti biologinius fermentus, didelės sąnaudos ir būtinybė tiksliai kontroliuoti reakcijos sąlygas.
Ląstelių kultūros:
Ląstelių kultūra yra kisspeptino sintezės laboratorijoje metodas. Šis metodas apima ląstelių linijos, turinčios Kisspeptin geno seką, kultivavimą, o tada iš auginimo terpės išskiriamą Kisspeptin surinkimą. Konkrečiai, Kisspeptin genų seka pirmiausia įterpiama į ląstelių liniją, po to atliekama ląstelių kultūra ir optimizuojama būklė. Galiausiai iš auginimo terpės paimamas kisspeptinas. Ląstelių kultūros pranašumas yra tas, kad ji gali pagaminti didelį kiekį Kisspeptin, o šio metodo veikimas yra gana paprastas.
Apibendrinant galima pasakyti, kad yra įvairių Kisspeptin sintezės laboratorijoje metodų, kiekvienas metodas turi savų privalumų ir trūkumų. Sintezei galima parinkti tinkamus metodus pagal faktinius poreikius. Tarp jų cheminė sintezė ir genų inžinerijos sintezė yra dažniausiai naudojami metodai, o fermentinė hidrolizė ir ląstelių kultūra yra kitos įmanomos galimybės.