L-tioglutamo rūgštisyra natūralus produktas, paverčiamas iš į gliukozinolatą panašių pirmtakų grannymonda daržovėse, tokiose kaip lapiniai kopūstai, garstyčių žalumynai ir brokoliai. Jis turi įvairų poveikį sveikatai ir yra plačiai naudojamas lėtinių ligų, tokių kaip vėžys, širdies ir kraujagyslių ligos, diabetas, prevencijai. Jis plačiai randamas kryžmažiedžių augaluose, tokiuose kaip lapiniai kopūstai, žiediniai kopūstai ir kopūstai. Jis turi daug farmakologinių veiklų, tokių kaip priešvėžinis, priešuždegiminis, antioksidacinis, neuroprotekcinis ir kt. Todėl sintetinis L-tioglutamo rūgšties metodas sulaukė daug dėmesio.
Šiuo metu L-tioglutamo rūgšties sintezės metodus galima suskirstyti į dvi kategorijas: biologinę fermentaciją ir cheminę sintezę. Šie du metodai yra išsamiai aprašyti toliau.
L-Sulforafano biologinės fermentacijos metodas:
Biologinės fermentacijos metodas yra junginių sintezės su mikroorganizmais metodas. Atliekant bakterijų padermių atranką ir optimizuojant auginimo sąlygas, mikroorganizmai gali gaminti L-tioglutamo rūgštį fermentacijos proceso metu. Dabar buvo nustatyta, kad daugelis padermių gali sintetinti L-tioglutamo rūgštį, pavyzdžiui, Escherichia coli, Streptococcus thermophilus ir pan. Tarp jų labiausiai paplitęs L-tioglutamo rūgšties sintezės būdas naudojant Escherichia coli padermes. Konkretūs veiksmai yra tokie:
1. Išskirkite L-tioglutamatą gaminančias padermes, tokias kaip Escherichia coli, iš dirvožemio arba augalo audinio;
2. Escherichia coli auginimui pritaikykite tinkamas terpę ir auginimo sąlygas, tokias kaip temperatūra, pH vertė, auginimo laikas ir kt.;
3. Surinkite Escherichia coli fermentacijos sultinį, atlikite tam tikrą apdorojimą ir gryninimą ir gaukite L-tioglutamo rūgštį.
L-Sulforafano cheminės sintezės metodas:
Cheminės sintezės metodas yra cheminės molekulinės reakcijos metodo naudojimas, norint sintetinti L-tioglutamo rūgštį skirtingais sintetiniais būdais. Šiuo metu cheminės sintezės metodai daugiausia skirstomi į keturis tipus: cholino druskos metodą, sulfurilchlorido metodą, karbonilo redukcijos metodą ir agarozės sulfato metodą.
1. Cholino druskos metodas:
Šis metodas yra vienas iš dažniausiai naudojamų sintetinių metodų. Tęskite taip:
① Pirma, L-metioninas ir cholinas reaguoja rūgštinėmis sąlygomis, kad susidarytų retas azoto pakaitalas L-tioglutamo rūgštis.
② Azoto pakaitalų kaitinimas ir hidrolizavimas į L-tioglutamo rūgštį šarminėmis sąlygomis.
Šio metodo pranašumas yra tas, kad reakcija yra paprasta ir lengvai įvaldoma, tačiau išeiga nedidelė.
2. Sulfonilchlorido metodas:
Šis metodas naudoja elektrofilinę pakeitimo reakciją, kad būtų sintetinama L-tioglutamo rūgštis. Tęskite taip:
① L-metionino ir sulfonilchlorido reakcija šarminėmis sąlygomis, siekiant gauti L-tioglutamo rūgšties sulfinatą.
② Sulfinatas hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis, kad susidarytų L-tioglutamo rūgštis.
Šio metodo pranašumas yra tas, kad reakciją lengva kontroliuoti, o išeiga yra didelė, tačiau reikia naudoti toksišką sulfonilchloridą.
3. Karbonilo redukcijos metodas:
Metodas yra panaudoti redukcijos reakciją L-tioglutamo rūgščiai sintezuoti. Tęskite taip:
①L-metioninas reaguoja su acetoniminu ir tuo pačiu metu susidaro piridino pirimidin-2-en-4-vienas ir pirimidino pirimidin-2-en-4-vienas-5- sulfatas
②Pirimidino pirimidino-2-en-4-vienas-5-sulfatas redukuojamas, kad būtų gauta L-tioglutamo rūgštis.
4. Agarozės sulfato metodas. Šis metodas yra L-metionino ir agarozės sulfato reakcija rūgštinėmis sąlygomis, kad susidarytų L-tioglutamo rūgštis. Dėl gero katalizinio sulfato aktyvumo pagerėja reakcijos efektyvumas ir selektyvumas. Aukštesnis, bet sudėtingesnis valdymas.
Moksliniuose tyrimuose L-sulforafano nustatymas yra labai svarbus. Tarp jų agarozės sulfato metodas yra vienas iš klasikinių aptikimo metodų. Agarozės sulfato metodas ir jo etapai bus išsamiai aprašyti toliau.
Eksperimento principas
Agarozės sulfato metodas pagrįstas geltonojo L-tiogalaktopino ir bario sulfato komplekso, druskos, susidariusios rūgštinėmis sąlygomis, susidarymu, naudojant agarozę kaip pagrindą L- Sulforafano metodas. Metodas pagrįstas tuo, kad rūgštinėmis sąlygomis geltonas kompleksas, susidaręs bario sulfato ir L-sulforafano reakcijos metu, sunkiai tirpsta vandenyje ir nusėda agarozėje, kad būtų atskirtas ir aptiktas L-sulforafanas.
Eksperimento žingsniai:
1 veiksmas: Paruoškite agarozės-bario sulfato suspensiją
Pasverkite atitinkamą kiekį agarozės ir bario sulfato, sumaišę įpilkite tam tikrą kiekį distiliuoto vandens ir gerai išmaišykite, pakaitinkite, kol ištirps arba tolygiai susimaišys, suspensiją filtruokite filtru, kurio porų dydis yra 0,22 um, ir tada virkite 3–5 minutes. Kai suspensija atvės iki žemiau 50 laipsnių, bet vis tiek nesustingsta, supilkite tirpalą į Petri lėkštelę ir laikykite kambario temperatūroje, kol sustings.
2 veiksmas: mėginio paruošimas ir apdorojimas:
Pasverkite bandinį arba etaloną, kurį norite ištirti, įpilkite pakankamai {{0}}.01 M natrio pirofosfato tirpalo, kad ištirptų, įpilkite atitinkamą tūrį chloroformo, kad ištrauktumėte, centrifuguokite 10-15 min. , pašalinkite viršutinio sluoksnio skystį, išgarinkite chloroformą, kad surinktumėte likučius, įpilkite 2 ml vandens ir 2 ml koncentruotos druskos rūgšties, vėl ekstrahuokite chloroformu, centrifuguokite ir paimkite viršutinį sluoksnį. Paimkite 24 ml viršutinio skysčio, įpilkite 0,2 ml 2% vario nitrato tirpalo ir 0,4 ml 5% švino nitrato tirpalo, vieną kartą ekstrahuokite chloroformu, centrifuguokite ir paimkite viršutinį skystį, kurį galima naudoti kaip eksperimentinį mėginį tyrimams.
3 veiksmas: pakartotinės analizės eksperimentas:
Mėginiai buvo dedami į agarozės-bario sulfato suspensiją ir kaitinami vandens vonioje, kad sukietėtų 80 laipsnių temperatūroje 2 valandas. Mėginiui sukietėjus, agarozės-bario sulfato suspensija atšaldoma iki kambario temperatūros, o agarozės-bario sulfato ir mėginio kompleksas ištirpinamas citrinos rūgšties ir amonio druskos buferinėmis sąlygomis. Galiausiai nuosekliai nuplaukite vandeniu ir vizualiai patikrinkite komplekso spalvą agarozės sferoje.
4 veiksmas: rezultatų analizė:
Po pakartotinės analizės išmatuokite filtrato absorbciją, kad sudarytumėte standartinę kreivę ir gautumėte L-sulforafano kiekį.
Agarozės sulfato metodas yra klasikinis L-sulforafano atskyrimo ir nustatymo metodas. Atlikus kelis veiksmus, L-sulforafanas gali būti atskirtas ir jo kiekis aptiktas. Metodas turi paprastumo, didelio jautrumo ir tikslių rezultatų privalumus ir dažniausiai naudojamas aptikti L-sulforafaną maiste, kosmetikoje ir farmacijoje.
Santrauka: Tobulėjant mokslui ir technologijoms, L-tioglutamo rūgšties sintezės metodas yra nuolat optimizuojamas ir tobulinamas. Tuo pačiu metu biologinės fermentacijos metodas ir cheminės sintezės metodas taip pat turi savų privalumų ir trūkumų, o kurį metodą naudoti, priklauso nuo faktinės situacijos.